Prueba de Fenotipificación

¿CÓMO SE REALIZA LA FENOTIPIFICACIÓN?

La primera prueba que se lleva a cabo antes de la fenotipificación es la que mide la concentración (nivel) de alfa-1 antitripsina (AAT) en la sangre. Se utilizan varios métodos distintos, pero todos utilizan un anticuerpo para hallar y medir la AAT en sangre. A esta prueba también se le llama proteinograma. El resultado de esta prueba se expresa en términos de un número. Las personas con Deficiencia de Alfa-1 Antitripsina (Alfa-1) tienen niveles en sangre que son entre 10-15 por ciento de lo normal.

La fenotipificación es una prueba completamente independiente que determina el tipo de AAT en su sangre en lugar de la cantidad. En comparación con la medición de los niveles de AAT, la fenotipificación es más un tipo de arte que se resiste a la automatización.

¿Cómo funciona?

La mayor parte de la AAT es producida en el hígado. Las personas con Deficiencia de Alfa-1 Antitripsina han heredado dos genes anormales de sus padres, cada uno de los cuales da instrucciones ligeramente incorrectas para la producción de la AAT. Las células del hígado obtienen las instrucciones del código del ácido dexirribonucléico (ADN) que se encuentra en los genes AAT. Siguiendo dichas instrucciones, las células hepáticas normalmente ensamblan una larga cadena de unos 394 aminoácidos, la cual luego de ser terminada se dobla en sí misma (plega) en una forma muy precisa hasta convertirse en una molécula redondeada de AAT. La molécula normal de AAT siempre se produce utilizando exáctamente los mismos aminoácidos, los cuales se conectan exáctamente en el mismo orden cada vez.

A pesar de que cada molécula normal de AAT se comienza a formar idénticamente, antes de que la molécula sea liberada por el hígado, a la misma se le añaden azúcares específicos. El proceso de añadir azúcares es más variable que el proceso de conectar los aminoácidos, por lo que la molécula de AAT terminada puede variar ligeramente una de otra por su contenido de azúcar. Esto tiene un efecto importante en la fenotipifación, como se explica más adelante.

La carga eléctrica de la proteína AAT puede ser cambiada por el ácido. De hecho, si la cantidad de ácido que rodea la molécula es cambiada a una cantidad específica, la carga eléctrica neta de toda la molécula puede ser cambiada a cero. La cantidad de ácido (la cual se mide por el pH) que se requiere para reducir a cero la carga neta de la molécula se conoce como "punto isoeléctrico". Cada molécula tiene su propio punto isoeléctrico.

¿Cómo se lleva a cabo la prueba de fenotipificación?

La prueba se lleva a cabo por electroforesis (isoelectric focusing). Esto significa utilizar un método que concentra las moléculas de AAT en una forma que depende de su punto isoeléctrico.

Para realizar la fenotipificación, se coloca una pequeña cantidad de sangre o plasma (aproximadamente 1/10 de una gota) en una fina capa de un gel especial (se ve como una fina capa de gelatina trasparente). El truco de esta prueba está en que el gel contiene "amofilinas" o moléculas que modifican la acidez (pH) del gel cuando son expuestas a una corriente eléctrica . De esta forma, cuando la corriente pasa a través del gel, ocurre un cambio sutil en el pH de un extremo al otro del gel.

Cuando la muestra de sangre que contiene AAT es añadida al gel, la corriente eléctrica mueve cada molécula de AAT hacia una u otra dirección en el gel, dependiendo de la carga neta de la molécula. Las moléculas cargadas positivamente se mueven en una dirección y las cargadas negativamente se mueven en otra, mientras que las que tienen una carga neutral (cero) no se mueven. Si el gel ha sido preparado correctamente, las moléculas de AAT se moverán dentro del gel hasta que encuentren el lugar donde el pH es igual a su punto isoeléctrico, y ahí se detendrán. De esta forma, las moléculas con el mismo punto isoeléctrico se concentrarán en el mismo lugar en el gel. Esta prueba es tan sensitiva que aún moléculas ligeramente diferentes se moverán a sitios distintos en el gel. Luego se remueve la corriente y se añade un tinte que "pinta" la(s) proteína(s) para mostrar los lugares (o bandas) donde la AAT de la muestra se ha concentrado.

El último paso en la fenotipificación consiste en la observación del gel por una persona experimentada quien le asignará un fenotipo. La interpretación de los resultados se dificulta por la variabilidad de las azúcares que están unidas a cada molécula de AAT, por lo que cada tipo (variante) de AAT se mueve al menos a cinco bandas distintas dentro del gel. La sangre de aquellas personas que tienen más de un tipo de AAT presentará más bandas todavía. Esto dificulta la interpretación de los resultados.

¿Qué resultados pueden esperarse?

Se le han asignado letras del alfabeto a los distintos tipos de AAT, de acuerdo al lugar donde las moléculas se concentran en el gel (movilidad electroforética). Se han descrito más de 100 variantes de AAT, pero la mayoría de estas son bastante raras.

La mayor parte de las personas tienen sólo AAT "normal" en su sangre. La mayor parte de las variantes normales de AAT se les identifica como tipos "M", porque estas migran cerca del centro del gel. La variante Z migra a la parte de abajo del gel. La otra variante común, la variante S, migra entre la M y la Z. Las variantes S y Z se concentran de forma anormal porque cada una contiene un aminoácido que cambia la carga neta de la AAT. Por ejemplo, la variante Z contiene en la posición 342 de la cadena de aminoácidos de la molécula el aminoácido lysina (que tiene una carga positiva) en el lugar del aminoácido correcto, glutamina (que tiene una carga negativa). El gen Null o Nulo no produce cantidades detectables de AAT en la sangre por lo que no puede ser detectado por la prueba de fenotipificación. El gen Nulo es considerado muy raro.

Los resultados de las personas que sólo tienen en su sangre AAT normal usualmente se reportan como "Pi*M". La mayoría de las personas con deficiencia severa de la proteína AAT tienen sólo la variante Z en su sangre, por lo que su fenotipo es "Pi*Z". En la sangre de los portadores de genes AAT deficientes severos encuentran más de una variante de AAT, y su resultado reflejará ambos tipos de AAT como por ejemplo Pi*MZ y Pi*MMmalton. La fenotipificación es de gran ayuda en la detección de los portadores, quienes algunas veces pueden tener cantidades normales de AAT en su sangre. El tipo más común de portador tiene una variante normal de AAT y una variante deficiente en su sangre (Pi*MZ). El otro tipo de portador relativamente más común es el heterozigoto Pi*SZ.  La variante S es ligeramente deficiente, mientras que la variante Z es considerada deficiente several. En el caso de las personas Pi*SZ es importante determinar el nivel en sangre, ya que algunos podrían tener niveles por debajo de los considerados protectores y estar en riesgo de padecer de enfermedad pulmonar crónica.

¿Por qué es de ayuda la fenotipificación?

La fenotipificación es una prueba completamente diferente a la que mide los niveles de AAT en su sangre. Esta prueba añade una medida adicional de certeza al diagnóstico de Alfa-1. Esta prueba es indispensable para identificar a los portadores de genes AAT deficientes quienes podrían presentar niveles normales de AAT.

Otras consideraciones.

Si usted obtiene en la prueba de fenotipificación un resultado Pi*Z quiere decir que sólo se ha detectado en su su sangre la variante Z. No es correcto decir que una persona tiene un fenotipo Pi*ZZ como resultado de la prueba de fenotipificación. Lo mismo sucede en el caso de una pesona que sólo tiene en su sangre un tipo de proteína porque heredó el mismo gen de cada uno de sus padres.

El siguiente ejemplo ilustra este punto: Todos heredamos dos genes (uno de cada padre) para la producción de la proteína AAT. En el caso de las personas que han heredado un gen Z y un gen Null o Nulo  (no produce cantidades detectables de la proteína AAT) cuando se realiza la prueba de fenotipificación sólo se detecta la proteína Z debido a que el gen Null no produce cantidades de la proteína AAT detectables en sangre. De la misma forma, si usted tiene el fenotipo Pi*M o el Pi*S o cualquier otro fenotipo detectable, usted no necesariamente ha heredado el mismo gen AAT de ambos padres (Ej. Pi*MM o Pi*SS), porque usted podría tener un gen nulo que no se detecta con la prueba de fenotipificación. Por tal razón es importante siempre realizar los niveles en sangre de la proteína AAT. Un claro ejemplo sería el caso de un un Pi*M con niveles por debajo de lo normal lo que sugiere la presencia de un gen Nulo. En esta situación realizar un estudio genético familiar aclararía el asunto.

Finalmente, la fenotipificación puede dar un resultado falso en personas que reciben la terapia de reemplazo AAT. Debido a que la fenotipificación detecta tanto la proteína AAT producida por la persona, como la  de reemplazo, estas personas parecen ser portadores Pi*MZ, cuando en la realidad no lo son.

Información Adicional sobre las Pruebas.

www.labcorp.com/datasets/labcorp/html/chapter/mono/sc000900.htm

www.labtestsonline.org/understanding/analytes/alpha1_antitrypsin/glance.html